|
|
Analýza promotorů genů kódujících faktory sigma u patogenních korynebakterií s využitím modelu Corynebacterium glutamicum
Kučera, Tomáš ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo identifikovat potenciální promotory genů kódujících faktory sigma u patogenních korynebakterií s využitím modelové bakterie Corynebacterium glutamicum a posoudit vliv sekvence aminokyselin proteinů sigma na rozpoznání promotoru. Faktory sigma jsou nezbytné pro transkripci a regulaci genové exprese a hrají klíčovou roli při řízení aktivity promotorů. Pochopení regulace genů kódujících faktory sigma je zásadní, protože přispívají k virulenci a patogenitě a regulují obrannou reakci proti imunitnímu systému hostitele. V této práci se analyzovaly promotorové oblasti genů kódujících faktory sigma u bakterií Corynebacterium ulcerans a Corynebacterium diphtheriae. Nejprve byly identifikovány potenciální sekvence promotorů v genomech C. ulcerans a C. diphtheriae na základě znalosti konvenčních sekvencí potvrzených promotorů v modelovém organismu. Vyhodnocení aktivity navržených promotorových oblastí sloužil odzkoušený dvouplazmidový systém vytvořený v C. glutamicum. Do vektoru pEPR1 byla vložena potenciální promotorová oblast před reportérový gen gfpuv a do vektoru pEC-XT99A byly před inducibilní promotor vloženy geny faktorů sigma. S využitím fluorescence se měřila aktivita reportérového genu v reakci na indukovaný faktor sigma z C. glutamicum, C. ulcerans nebo C....
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Překryvy regulonů faktorů sigma RNA polymerázy u Corynebacterium glutamicum
Zíková, Jaroslava ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Sudzinová, Petra (oponent)
Faktor sigma (σ) je součástí enzymového komplexu RNA polymerázy. Tento komplex (označovaný jako holoenzym) zajišťuje rozeznání konvenční (consensus) sekvence promotorů jednotlivých genů a iniciaci transkripce. U bakterie Corynebacterium glutamicum bylo nalezeno sedm faktorů. Genom této bakterie kóduje jeden primární faktor σA a dalších šest alternativních faktorů sigma: σB , σC , σD , σE , σH a σM . Tyto alternativní faktory sigma se exprimují v reakci na změny vnitřního nebo vnějšího prostředí a zajišťují přizpůsobení bakterie růstovým podmínkám. Jsou také jedním z mnoha regulátorů exprese genů na úrovni transkripce. Ve specifických případech je regulace exprese genů způsobena alternativními faktory sigma, které rozeznávají příslušné duální (rozpoznávané alternativně dvěma faktory sigma) nebo překrývající se promotory. Tím se geny řízené těmito promotory dostávají do překrývajících se sigma regulonů. Klíčová slova: Corynebacterium glutamicum, faktor sigma, RNA polymeráza, transkripce, promotor, regulony, RNA-seq, in vitro transkripce, in vivo dvouplazmidový test
|
|
|
Funkce stresových sigma faktorů RNA polymerasy SigD, SigE, SigH a SigM v transkripční regulační síti Corynebacterium glutamicum
Dostálová, Hana ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Bobek, Jan (oponent) ; Halgašová, Nora (oponent)
Grampozitivní bakterie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 je významným průmyslovým producentem aminokyselin a dalších metabolitů. Její genom kóduje 7 podjednotek sigma (σ) RNA polymerázy: primární faktor σA , primárnímu faktoru podobný σB a pět alternativních faktorů sigma, σC , σD , σE , σH a σM (faktory s extracytoplazmatickou funkcí). Tato práce se zaměřila na odhalení dosud neznámých regulonů stresových faktorů sigma nebo upřesnění popisu regulonů, jejichž geny jsou řízeny faktory σD , σE , σH a σM , které byly zčásti popsány pro svou aktivitu při odpovědích na povrchový (σD a σE ), tepelný (σE , σH a σM ) a oxidativní stres (σH a σM ). Vycházeli jsme z toho, že geny každého regulonu jsou přepisovány z jedné třídy promotorů. Pro účely detailní analýzy promotorů bylo třeba vyvinout metody, které rychle a spolehlivě přiřadí faktor sigma k jednotlivým promotorům, a tedy i genům. K tomuto účelu byla vyvinuta kombinace metod in vivo (dvouplazmidový systém) a in vitro (in vitro transkripce) umožňující zpřesnit toto přiřazení. Těmito metodami jsme identifikovali 9 σH /σE -promiskuitních promotorů (PamtR, Pcg0378, Pcg1121, Pcg3309, Pcg3344, PclgR, PdnaJ, PdnaK a PsigB), 7 σD /σH -promiskuitních promotorů (Pcg0607, Pcg2047, Pcmt2, PfadD2, Plpd, PlppS a PrsdA) a 9 σH /σM -promiskuitních promotorů...
|
|
|
Hybridní faktory sigma RNA polymerasy u Corynebacterium glutamicum
Blumenstein, Jan ; Štěpánek, Václav (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
půdní bakterie využívaná průmyslu jako producent aminokyselin, nukleotidů, biopaliv a alkoholů. Cílem této práce bylo vytvořit hybridní faktor σ rozpoznávat pouze příslušný hybridní promotor, takže neovlivní e genů. Na základě aminokyselinových sekvencí faktorů σ a σ genů navrženy 2 typy hybridních faktorů σ σ σ σ byly dále na základě přirozeného faktoru σ σ promotoru. Hybridní promotory byly vytvořeny kombinací 10, které pocházely ze σ a σ ů promotorů s použitím prokázalo, že exprese genu σ σ kmeny, které nesly přirozený faktor σ a příslušný promotor. Při použití jednoho z ů σ σ ) se záměnami 35 σ promotorů došlo k a tedy dosažení cíle. Klíčová slova:
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Regulační síť řízená sigma faktory RNA polymerasy v Corynebacterium glutamicum
Kučera, Tomáš ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Roučová, Kristina (oponent)
Důležitou vlastností bakterií je schopnost přizpůsobit se změně prostředí pomocí regulace exprese genů. Úroveň exprese genů a její načasování závisí hlavně na aktivaci nebo represi daného genu transkripčními regulátory a rozpoznání příslušeného promotoru faktorem sigma, který je podjednotkou RNA polymerázy. Transkripční regulátory společně s faktory sigma a dalšími řídícími elementy tvoří komplexní regulační síť. Regulační síť v Corynebacterium glutamicum je díky sekvenaci genomu a aplikaci řady technik na úrovni genomu jednou z nejlépe prostudovaných v rámci grampozitivních bakterií. Bylo dosaženo mnoha úspěchů v porozumění rolí jednotlivých regulátorů a interakcí mezi regulátory v závislosti na změnách prostředí. Tato práce shrnuje dosud známé poznatky vzájemných vztahů mezi faktory sigma, vlivu faktorů sigma na transkripčními regulátory a jejich společné působení na iniciaci transkripce. V práci je schématicky vytvořena regulační síť faktorů sigma v C. glutamicum a regulační kaskáda v reakci na stresovou situaci. Klíčová slova: faktor sigma (FS), Corynebacterium glutamicum, transkripční regulátor (TR), transkripce, regulace
|
|
|
Vlastnosti expresních vektorů pro Corynebacterium glutamicum a jejich využití při studiu faktorů sigma RNA polymerasy
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Cílem práce bylo charakterizovat vybrané expresní vektory pro biotechnologicky významný bakteriální druh, Corynebacterium glutamicum, a testovat možnosti jejich využití při studiu řízení aktivity promotorů faktory sigma RNA polymerasy. Měřením míry exprese modelového genu gfpuv stanovením intenzity fluorescence produkovaného proteinu a použitím analýzy populace buněk C. glutamicum exprimujících gen gfpuv pomocí průtokové cytometrie byly u studovaných vektorů zjištěny odlišné vlastnosti: míra exprese klonovaného genu, bazální hladina exprese bez induktoru, závislost míry exprese na koncentraci induktoru a stupeň homogenity buněk z hlediska exprese genu gfpuv. Pro testování biplasmidového systému pro přiřazení faktoru sigma k vybranému promotoru byl zvolen vektor pEC-XT99A, který sice neměl vysokou účinnost exprese, ale nevykazoval bazální expresi, exprese byla srovnatelná v širší škále koncentrací induktoru IPTG a buněčná populace byla z hlediska exprese modelového genu zcela homogenní. S využitím vektoru pEC-XT99A, který exprimoval jednotlivé geny pro stresové faktory sigma, byl dosud neznámému promotoru Pcg0420 jednoznačně přiřazen faktor σD , který řídil jeho funkci. Další vektor, určený pro izolaci a purifikaci proteinů z C. glutamicum, umožnil expresi genu sigM z C. glutamicum a izolaci proteinu σM...
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
host ::
RSS.